Лабораторная работа: Определение общего билирубина и его фракций в сыворотке крови и моче

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИЛИРУБИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Билирубин и его фракции

 

КОГДА ВАЖНО ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИЛИРУБИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

 

Определение билирубина в сыворотке крови используется для:

 ·         исследования работы печени;

·         постановки диагноза – гепатит на ранней стадии, цирроз, жировое перерождение, алкогольная болезнь печеночной ткани, раковая опухоль печени или метастазы, врожденные нарушения обмена билирубина;

·         выявления ускоренного разрушения эритроцитов при гемолитической анемии (врожденные, аутоиммунные или токсические, после переливания крови);

·         дифференциальной диагностики (отличия) физиологической (естественной) желтухи новорожденного от опасной ядерной энцефалопатии (избыток билирубина откладывается в ядрах головного мозга);

·         выяснения степени закупорки желчных путей при наличии камня, опухоли или воспаления с нарушением оттока желчи;

·         контроля за лечением болезней печени, крови и желчевыводящей системы;

·         оценки повреждающего действия медикаментов.

 

Схема обмена билирубина

 

СИМПТОМЫ, ПРИ КОТОРЫХ НУЖНО ПРОЙТИ АНАЛИЗ:

• пожелтение кожи;
• упорный зуд кожных покровов;
• потемнение мочи;
• слабость и утомляемость, ломота в костях, суставах в сочетании с болью, тяжестью в правом подреберье.

ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЯ

Показатель билирубина имеет диагностическое значение при:

·         ускоренном гемолизе (разрушении эритроцитов) на фоне анемии, малярии, заражении крови (сепсис);

·         повреждении печени вирусом, алкоголем, ядом – гепатите;

·         гнойнике в печеночной ткани (абсцесс);

·         замещении разрушенной ткани рубцовыми волокнами – цирроз;

·         опухолевом процессе в печени (первичный рак) или метастазировании из других органов;

·         подпеченочной закупорке желчных путей – желчнокаменная болезнь, опухоль поджелудочной железы или панкреатит, холангит, холецистит.

Все эти болезни протекают с повышением общего билирубина, но его фракции (прямая и непрямая часть) растут в разной степени. Поэтому исследование помогает отличить вид желтухи:

·         надпеченочная (гемолитическая),

·         внутрипеченочная (паренхиматозная),

·         подпеченочная (механическая).

 

Снижение билирубина имеет низкое диагностическое значение и встречается при нарушении правил проведения анализа (употребление алкоголя, кофе, снотворных, антибиотиков, гормонов, противосудорожных). Причиной низких показателей бывает и нахождение в светлом месте сыворотки из венозной крови.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИЛИРУБИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Одного рекомендованного метода (референсного) для определения билирубина в сыворотке крови нет, в разных лабораториях могут использовать такие способы:

 

Для исследования общего билирубина и его фракций применяются:

1. Прямые спектрофотометрические методы, основаны на измерении абсорбции билирубина при 440‑460 нм, источником ошибок здесь является интерференция желтых небилирубиновых пигментов;

2. Ферментативные методы, основаны на окислении пигмента медьсодержащим ферментом билирубиноксидазой (КФ 1.3.3.5.), с образованием биливердина и исчезновением абсорбции при 460 нм. Методы этой группы точны и отличаются высокой специфичностью и чувствительностью;

3. Колориметрические диазометоды, базируются на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. Под воздействием кислоты разрывается тетрапирроловая структура билирубина с образованием двух дипирролов, углеродные атомы метиленовых групп вступают в прямую реакцию с диазотированной сульфоновой кислотой (диазосмесь) с образованием розово-фиолетовых изомеров азодипиррола с максимумом поглощения при 530 нм. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный –– только после добавления акселератора (кофеин, метанол, мочевина, бензоат или гидроокись натрия, уксусная кислота и другие). Последний освобождает билирубин из комплекса с белками и тем самым ускоряет реакцию азосочетания. Образовавшийся азокраситель ведет себя как кислотно-основной индикатор с несколькими цветными переходами: в сильнокислой среде он окрашен в фиолетовый цвет, в слабощелочной и слабокислой — в розовый, в сильнощелочной среде — в синий или зеленый цвета.

4. Электрохимические методы с использованием платинового и ртутного электродов;

5. Хроматографическое разделение отдельных фракций билирубина;

6. Флюорометрические методы, используется свойство свободного билирубина после поглощения при 430 нм испускать свет длиной 520 нм. Позволяют определить концентрацию неконъюгированного билирубина и, после обработки детергентом, общего билирубина главным преимуществом метода является возможность использовать микроколичества сыворотки.

 

Унифицированным методом определения количества билирубина в сыворотке является метод Йендрашика‑Клеггорна‑Грофа по диазореакции в щелочной или слабокислой среде в присутствии акселератора.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БИЛИРУБИНА И ЕГО ФРАКЦИЙ
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПО ДИАЗОРЕАКЦИИ

 

ПРИНЦИП

Билирубин взаимодействует с диазотированной сульфоновой кислотой в присутствии кофеина с образованием окрашенных азопигментов.

Нормальные величины

ВЛИЯЮЩИЕ ФАКТОРЫ

Завышенные результаты вызывает гемолиз, прием стероидных препаратов, эритромицина, фенобарбитала, употребление пищи, содержащей каротиноиды (морковь, абрикосы). Длительное стояние сыворотки на свету вызывает окисление билирубина и занижает значения.

КЛИНИКО‑ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Сыворотка

Накопление билирубина в крови свыше 43 мкмоль/л ведет к связыванию его эластическими волокнами кожи и конъюктивы, что проявляется в виде желтухи. Для дифференциальной диагностики желтух необходимо определить, за счет какой фракции возникает билирубинемия:

 

1. Гемолитическая или надпеченочная желтуха — ускоренное образование билирубина в результате внутрисосудистого гемолиза. Это гемолитические анемии различного происхождения: отравление сульфаниламидами,талассемии, сепсис, лучевая болезнь, несовместимость крови, врожденный сфероцитоз, серповидно-клеточная анемия, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

В данном случае гипербилирубинемия развивается за счет фракции непрямого билирубина. Гепатоциты усиленно переводят непрямой билирубин в связанную форму, секретируют его в желчь, в результате в кале увеличивается содержание стеркобилина, интенсивно его окрашивая. В моче резко возрастает содержание уробилина, билирубин отсутствует.

У новорожденных гемолитическая желтуха может развиться как симптом гемолитической болезни новорожденного.

 

2. Паренхиматозная (печеночно-клеточная) желтуха – причиной может быть нарушение на всех стадиях превращения билирубина в печени: извлечение билирубина из крови печеночными клетками, его конъюгирование и секреция в желчь. Наблюдается при вирусных и других формах гепатитов, циррозе и опухолях печени, жировой дистрофии, при отравлении токсическими гепатотропными веществами, при врожденных патологиях.

Так как в печени недостаточно проходят все реакции превращения билирубина, гипербилирубинемия развивается за счет обеих фракций, преимущественно фракции прямого билирубина. Количество непрямого билирубина возрастает за счет функциональной недостаточности гепатоцитов и/или снижения их количества, а прямого — за счет увеличения проницаемости мембран клеток печени, также из-за нарушения секреции в желчь.

В моче определяется билирубин (цвет крепкого черного чая), умеренно увеличена концентрация уробилина, уровень стеркобилина кала в норме или снижен.

У младенцев вариантами паренхиматозной желтухи являются желтухи новорожденных и недоношенных: физиологическая желтуха, желтуха, вызываемая молоком матери, и т.п.. Наследственные желтухи печеночного происхождения представляют собой синдромы Жильбера-Мейленграхта, Дубина-Джонсона, Криглера-Найяра.

 

3. Механическая или подпеченочная желтуха развивается вследствие нарушения оттока желчи при закупорке желчного протока – желчные камни, новообразования поджелудочной железы, гельминтозы. Также подпеченочные желтухи выявляются при новообразованиях поджелудочной железы и гельминтозах.  

В результате застоя желчи происходит растяжение желчных капилляров, увеличивается проницаемость их стенок. Не имеющий оттока в желчь прямой билирубин поступает в кровь и развивается гипербилирубинемия за счет увеличения концентрации прямого билирубина. В моче резко увеличен уровень билирубина (цвет темного пива) и снижено количество уробилина, в кале практически отсутствует стеркобилин (серовато-белое окрашивание).

В тяжелых случаях, вследствие переполнения гепатоцитов прямым билирубином, конъюгация его с глюкуроновой кислотой может нарушаться и в крови будет увеличиваться количество несвязанного билирубина, т.е. присоединяется печеночно-клеточная желтуха.

Моча

Закупорка внепеченочных желчных путей является классической причиной билирубинурии. Показатель полезен в дифференциальной диагностике желтух, поскольку билирубинурия характерна для обтурационной и паренхиматозной желтух (повышение уровня связанного билирубина в сыворотке), но отсутствует при гемолитической. При гепатите билирубин может быть обнаружен в моче до появления желтухи.

Амниотическая жидкость

Билирубин содержится почти исключительно в неэтерифицированном виде в комплексе с альбумином и накапливается при эритробластозе, инфекционном гепатите и серповидноклеточном кризе у матери.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Принцип метода. Связанный билирубин при взаимодействии с диазореактивом (диазофенилсульфоновая кислота) образует розовое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. Кофеиновый реактив переводит несвязанный билирубин в растворимое состояние, благодаря чему он также реагирует с диазореактивом, образуя розовое окрашивание. По интенсивности этого суммарного окрашивания определяют концентрацию общего билирубина. А концентрацию не связанного билирубина определяют, как разность между общим и связанным билирубином.

 

Ход работы. В 3 пробирки приливают реактивы по схеме: 

Через 5-10 мин после прибавления диазореактива колориметрируют пробу на связанный билирубин (при более длительном стоянии пробы в реакцию вступает несвязанный билирубин, что искажает результат). Пробу на общий билирубин колориметрируют через 20 мин после добавления диазореактива. Колориметрирование проводят при зеленом светофильтре в кювете толщиной 0,5 см против контроля. Концентрацию общего и связанного билирубина определяют по калибровочному графику.

 

Нормальное содержание билирубина в сыворотке: общий – 1,7-20,5 ммоль/л, связанный – 0,86-4,3 мкмоль/л, свободный – 1,7-17,1 мкмоль/л.

 

Диагностическое значение определения билирубина в сыворотке крови.

 

Причины, вызывающие гипербилирубинемию, различны. Желтуха появляется, когда уровень билирубина в крови превышает 43 мкмоль/л. Заболевания, вызывающие повышение связанного билирубина: вирусный гепатит, цирроз печени, опухоль печени и метастазы, жировая дистрофия.

       

 Заболевания, вызывающие повышение несвязанного билирубина: гемолитическая анемия, пернециозная анемия, желтуха новорожденных.

 

Вопросы к защите лабораторной работы:

1. Объясните термины: общий билирубин, свободный билирубин, связанный билирубин, прямой билирубин, непрямой билирубин, конъюгированный билирубин, неконъюгированный билирубин.

2. Как образуется свободный билирубин?

3. Зачем в данном методе используется кофеиновый реактив?

4. Почему пробу на связанный билирубин колориметрируют точно через 5-10 минут?

5. Каков принцип метода определения билирубина в сыворотке крови?

6. Как определяют концентрацию общего и связанного билирубина?

7. Назовите причины гипербилирубинемии.

8. Какова норма свободного, связанного и общего билирубина?

Определение креатинина

КРЕАТИНИН

Содержание:

1. Методы определения концентрации креатинина
2. Определение концентрации креатинина в сыворотке крови методом Поппера
3. Нормальные величины
4. Влияющие факторы
5. Клинико-диагностическое значение
1. Сыворотка
2. Моча
3. Амниотическая жидкость

 

Существующие методы определения концентрации креатинина делятся на следующие группы.

1. Колориметрические:

·         основанные на реакции Яффе — реакция ароматических нитровеществ (пикриновая кислота) с веществами, содержащими активную метиленовую (=CH₂) или метиновую (=СH–) группы. Методы отличаются по способу осаждения белков плазмы или сыворотки (вольфраматом натрия, пикриновой кислотой, трихлоруксусной кислотой). Методы этой группы недостаточно специфичны, поскольку в той же области спектра поглощают также неспецифические хромогены — пикраты пировиноградной кислоты, ацетоуксусной кислоты, ацетона, глюкозы, производных креатинина (глюкоциамид, 5‑метилкреатинин). Метод с осаждением белков при помощи пикриновой кислоты (метод Поппера) является наиболее точным, так как, вероятно, при этом часть креатиноподобных хромогенов удаляется.

·         основанные на реакции креатинина с 3,5‑динитробензойной кислотой — окраска мало стабильна и метод применяется редко.

·         с ортонитробензальдегидом, базируется на превращении креатинина в метил‑гуанидин. Метод весьма специфичен, но трудоемок и длителен в исполнении.

·         с α‑нафтолом — в основе лежит реакция Сакагучи на аргинин: гуанидиновая группировка аргинина окисляется гипобромитом и аминокислота конденсируется с α‑нафтолом.

2. Ферментативные:

·         с ферментом креатинкиназой — точен, но требует специальной аппаратуры.

·         c использованием ферментов пируваткиназы, лактатдегидрогеназы — эти методы неспецифичны и дорогостоящи.

Унифицированным методом определения в сыворотке крови и моче является метод Поппера с соавт., основанный на реакции Яффе.

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ КРЕАТИНИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ МЕТОДОМ ПОППЕРА

 

ПРИНЦИП

Креатинин в щелочной среде дает цветную реакцию с пикриновой кислотой.

 

НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ

 

ВЛИЯЮЩИЕ ФАКТОРЫ

Повышение содержания отмечается при употреблении мясной пищи и при усиленной физической работе. 

Ложное увеличение показателя может вызвать липемия и гемолиз.

Ложное снижение — желтуха.

 

КЛИНИКО‑ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Уровень креатинина не является чувствительным показателем заболевания почек в ранней стадии.

 

СЫВОРОТКА

Увеличение содержания креатинина вызывается острым и хроническим нарушением функции почек различного генеза, закупоркой мочевых путей, кишечной непроходимостью, выявляется при заболеваниях печени, голодании, также наблюдается при акромегалии и гипертиреозе.

Гипокреатининемия отмечается при уменьшении мышечной массы, во время беременности (особенно I и II триместры).

 

МОЧА

Увеличение концентрации креатинина может быть связано с повышенной физической активностью, с лихорадочными состояниями, отмечается при выраженной недостаточности функции печени, при сахарном диабете, инфекциях. Снижение обнаруживается при голодании, у больных с мышечной атрофией, с дегенерацией и амилоидозом почек, лейкемией.

 

АМНИОТИЧЕСКАЯ ЖИДКОСТЬ

Накопление креатинина выявляется при беременности больных сахарным диабетом, преэклампсии.

Определение мочевины в моче и сыворотке

МОЧЕВИНА

Содержание:

1. Группы методов определения содержания мочевины
2. Определение мочевины в сыворотке крови и моче с диацетилмонооксимом
3. Определение мочевины уреазным методом
4. Нормальные величины
5. Влияющие факторы
6. Клинико диагностическое значение
1. Сыворотка
2. Моча

Основные группы методов определения содержания мочевины подразделяют на:

•         Ксантгидроловые: гетероциклический спирт ксантгидрол вступает в реакцию с мочевиной и образует нерастворимую диксантилмочевину, которую в дальнейшем определяют гравиметрически, нефелометрически, колориметрически или титрометрически. Методы точны, но трудоемки.

 

•         Гипохлоритные – метод Б.А.Рашкована, состоящий в появлении характерной окраски при взаимодействии мочевины с гипохлоритом натрия и фенолом, практически не применяется из‑за разного оттенка опытных и контрольной проб, частого появления мути при добавлении HCl.

 

•         Диацетилмонооксимные методы основаны на реакции Фирона – взаимодействии мочевины и диацетилмонооксима с образованием окрашенных продуктов, отличаются хорошей воспроизводимостью, высокой чувствительностью, большой специфичностью.

 

•         Полуколичественные методы с использованием индикаторной бумаги.

 

•         Методы с использованием ионоселективных электродов.

 

•         Ферментативные методы базируются на гидролизе мочевины уреазой (оптимум pH 6,0‑8,0). Образовавшийся аммиак определяют с помощью различных реакций (фенолгипохлоритная, с помощью глутаматдегидрогеназы, салицилатно‑гипохлоритная).

 

•         Газометрические (гипобромитные), основаны на окислении и разложении мочевины гипобромитом натрия в щелочной среде:

CO₂(NH₂) + 3NaBrO → N₂ + CO₂ + 3NaBr + H₂O

 

Выделяющуюся углекислоту поглощает раствор, свободным остается только азот, объем которого измеряют. Метод неспецифичен (так как гипобромит реагирует не только с мочевиной, но и другими веществами, содержащими аминогруппы), неточен, плохо воспроизводим и трудоемок.

В качестве унифицированных методов определения мочевины утверждены фенолгипохлоритный, диацетилмонооксимный и уреазный методы, экспресс‑метод с использованием индикаторной бумаги "Уреатест".

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЧЕВИНЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И МОЧЕ С ДИАЦЕТИЛМОНООКСИМОМ

Методы этой группы основаны на реакции Фирона, протекающей в два этапа. 

Первый этап заключается в гидролизе диацетилмонооксима с образованием диацетила и гидроксиламина.

На втором этапе гидроксиламин взаимодействует с мочевиной с образованием окрашенного диазинового производного. Для окисления гидроксиламина могут применяться: персульфат натрия, мышьяковая кислота, хлорная кислота, феназон, катионы. Для интенсификации окраски и ее стабильности применяются: тиосемикарбазид, фенилантраниловая кислота, глюкуронолактон, катионы, триптофан, нитриты.

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЧЕВИНЫ УРЕАЗНЫМ МЕТОДОМ

Ферментативные методы базируются на гидролизе мочевины уреазой в инкубационной среде с pH=6,0‑6,5 (ЭДТА‑буфер) или pH=6,9‑7,0 (фосфатный буфер) на углекислый газ и аммиак. Образовавшийся аммиак можно определить по высокочувствительной и специфичной реакции с фенолгипохлоритом и катализатором нитропруссидом, по салицилатно‑гипохлоритной реакции, по реакции с реактивом Несслера (является в 10 раз менее чувствительной по сравнению с фенолгипохлоритной, малоспецифична), по дихлоризоциануратной реакции (наличие белка мешает определению).

 

НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ

При необходимости сопоставления концентрации остаточного азота с содержанием азота мочевины концентрацию последней следует разделить на 2,14.

 

ВЛИЯЮЩИЕ ФАКТОРЫ

·         in vivo: увеличение — нефротоксичные препараты, кортикостероиды, избыток тироксина; снижение – увеличение концентрации соматотропного гормона,

·         in vitro: снижение (метод с уреазой) – цитрат натрия.

 

КЛИНИКО‑ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

 

СЫВОРОТКА

Уровень мочевины зависит от скорости ее синтеза в печени и выделения через почки, а также от величины белкового катаболизма.

Повышение уровня мочевины может наблюдаться при нарушении функции почек (острые и хронические заболевания, обтурация мочевых путей), нарушении почечной перфузии (застойная сердечная недостаточность), истощении запасов воды в организме (рвота, понос, повышенный диурез или потоотделение), повышенном катаболизме белка (острый инфаркт миокарда, стресс, ожоги, желтая атрофия печени, желудочно‑кишечные кровотечения), при диете с высоким содержанием белка. В тяжелых случаях острой почечной недостаточности выявлено 10‑кратное возрастание уровня мочевины. Так как водовыделительная функция почек восстанавливается быстрее, чем концентрационная способность, то нормальное выделение мочевины с мочой наступает значительно позднее, чем восстановление диуреза.

Снижение отмечается при диете с низким содержанием белка, при повышенной утилизации белка в тканях (поздние сроки беременности), тяжелых заболеваниях печени, сопровождающихся нарушением синтеза мочевины (паренхиматозная желтуха, цирроз печени).

 

МОЧА

Повышение количества мочевины в моче связано с гипертиреозом, злокачественной анемией, лихорадкой, при отравлении фосфором, отмечается при диете с высоким содержанием белка, в послеоперационном периоде.

Снижение наблюдается у больных с нефритом и другими заболеваниями почек, уремией, паренхиматозной желтухой, циррозом или дистрофией печени, также у здоровых растущих детей и при низкобелковой диете. 

Дополнительная литература:

1. Биохимический практикум

Олигосахариды. Дисахариды

ОЛИГОСАХАРИДЫ. ДИСАХАРИДЫ

Содержание:

1. Олигосахариды – определение
2. Строение дисахаридов
3. Биологическая роль дисахаридов
4. Распространение в природе
5. Физические свойства дисахаридов
6. Сахароза
1. Биологическая роль сахарозы
2. Строение сахарозы
3. Физические свойства и нахождение в природе
4. Химические свойства
5. Получение сахарозы
6. Применение сахарозы

Олигосахариды – это продукты конденсации двух или нескольких молекул моносахаридов. Наиболее распространёнными из олигосахаридов являются дисахариды и трисахариды.

 

Дисахариды – это углеводы, которые при нагревании с водой в присутствии минеральных кислот или под влиянием ферментов подвергаются гидролизу, расщепляясь на две молекулы моносахаридов.

 

Дисахариды – соединения, молекулы которых состоят из остатков двух моносахаридов, связанных между собой гликозидной связью.

Примером наиболее распространенных в природе дисахаридов являются сахароза (свекловичный или тростниковый сахар), мальтоза (солодовый сахар), лактоза (молочный сахар).

 

Все они являются изомерами и имеют общую формулу С₁₂Н₂₂О₁₁, однако их строение различно.

Учебный фильм «Углеводы. Дисахариды»

СТРОЕНИЕ ДИСАХАРИДОВ 

Молекулы дисахаридов могут содержать два остатка одного моносахарида или два остатка разных моносахаридов.

В образовании гликозидной связи одна молекула моносахарида всегда участвует своим полуацетальным (гликозидным) гидроксилом, а другая – либо полуацетальным, либо любым спиртовым гидроксилом.

Связи, образующиеся между остатками моносахаридорв, могут быть двух типов:

1.      Связь, в образовании которой принимают участие полуацетальные гидроксилы обеих молекул моносахаридов.

 

Например, образование молекулы сахарозы:

2.      Связь, в образовании которой принимают участие полуацетальный гидроксил одного моносахарида и спиртовый гидроксил другого моносахарида.

 

Например, образование молекул мальтозы и лактозы:

Отсутствие или наличие в молекулах дисахаридов полуацетального гидроксила отражается на их свойствах.

 

По типу дисахаридов построены молекулы других олигосахаридов и полисахаридов.

 

КЛАССИФИКАЦИЯ ДИСАХАРИДОВ

Дисахариды подразделяются на две группы: восстанавливающие и невосстанавливающие

 

Как видно из приведенных выше структурных формул дисахаридов, в молекулах мальтозы и лактозы сохраняется один полуацетальный гидроксил. Этот гидроксил в результате таутомерного превращения может образовывать альдегидную группу. Поэтому мальтоза и лактоза способны окисляться, т.е. обладают восстановительными свойствами (в частности, вступают в качественные реакции с Ag₂O, Cu (OH)₂). Дисахариды этого типа называются восстанавливающими.

 

Сахароза не содержит в своей структуре полуацетального гидроксила и относится к невосстанавливающим дисахаридам.

 

БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ДИСАХАРИДОВ

Дисахариды (сахароза, мальтоза) служат источниками глюкозы для организма человека, сахароза к тому же важнейший источник углеводов (она составляет 99,4%, от всех получаемых организмом углеводов). Лактоза используются для диетического детского питания.

 

РАСПРОСТРАНЕНИЕ В ПРИРОДЕ

Самый распространенный и важный дисахарид – сахароза. Это химическое название обычного сахара, который получают экстракцией из сахарной свеклы или сахарного тростника. Сахароза – главный источник углеводов в пище человека.

 

Лактоза – содержится в молоке ( от 2% до 8%) и получается из молочной сыворотки. Лактоза является основным углеводом молока и молочных продуктов. Ее роль весьма значительна в раннем детском возрасте, когда молоко служит основным продуктом питания.

Она применяют для приготовления питательных сред, например, при производстве пенициллина.

Мальтоза содержится в проросших зернах (солоде) хлебных злаков, меде, патоке и продуктах, изготовляемых с добавлением патоки (хлебобулочные, кондитерские изделия). Мальтоза также образуется при ферментативном гидролизе крахмала.

Мальтоза легко усваивается организмом человека.

ФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДИСАХАРИДОВ

Дисахариды – твердые кристаллические вещества, имеющие сладкий вкус.  Хорошо растворимые в воде, плохо — в спирте и практически нерастворимы в неполярных органических растворителях.

 

САХАРОЗА

 

Примером наиболее распространенных в природе дисахаридов (олигосахаридом) является сахароза (свекловичный или тростниковый сахар).

 

БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ САХАРОЗЫ

Наибольшее значение в питании человека имеет сахароза, которая в значительном количестве поступает в организм с пищей. Подобно глюкозе и фруктозе сахароза после расщепления ее в кишечнике быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта в кровь и легко используется как источник энергии.

Важнейший пищевой источник сахарозы — сахар.

 

СТРОЕНИЕ САХАРОЗЫ

Молекулярная формула сахарозы  С₁₂Н₂₂О₁₁.

 

Сахароза имеет более сложное строение, чем глюкоза. Молекула сахарозы состоит из остатков молекул глюкозы и фруктозы в их циклической форме. Они соединены друг с другом за счет взаимодействия полуацетальных гидроксилов (1→2) -гликозидной связью, то есть свободный полуацетальный (гликозидный) гидроксил отсутствует:

 

ФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА САХАРОЗЫ И НАХОЖДЕНИЕ В ПРИРОДЕ

Сахароза (обыкновенный сахар) – белое кристаллическое вещество, более сладкое, чем глюкоза, хорошо растворимое в воде.

Температура плавления сахарозы 160°C. При застывании расплавленной сахарозы образуется аморфная прозрачная масса – карамель.

Сахароза является весьма распространённым в природе дисахаридом, она встречается во многих фруктах, плодах и ягодах. Особенно много ее  содержится в сахарной свёкле (16-21%) и сахарном тростнике (до 20%), которые и используются для промышленного производства пищевого сахара.

Содержание сахарозы в сахаре 99,5%. Сахар часто называют «носителем пустых калорий», так как сахар – это чистый углевод и не содержит других питательных веществ, таких, как, например, витамины, минеральные соли.

 

ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

Для сахарозы характерны реакции по гидроксильным группам.

1. Качественная реакция с гидроксидом меди (II)

Наличие гидроксильных групп в молекуле сахарозы легко подтверждается реакцией с гидроксидами металлов.

Видеоопыт «Доказательство наличия гидроксильных групп в сахарозе»

Если раствор сахарозы прилить к гидроксиду меди (II), образуется ярко-синий раствор сахарата меди (качественная реакция многоатомных спиртов):

2. Реакция окисления

Восстанавливающие дисахариды

Дисахариды, в молекулах которых сохраняется полуацетальный (гликозидный) гидроксил (мальтоза, лактозы), в растворах частично превращаются из циклических форм в открытые альдегидные формы и вступают в реакции, характерные для альдегидов: реагируют с аммиачным раствором оксида серебра и восстанавливают гидроксид меди (II) до оксида меди (I). Такие дисахариды называются восстанавливающими (восстанавливают Cu (OH)₂ и Ag₂O).

 

Реакция «серебряного зеркала»

Реакция с гидроксидом меди (II)

Невосстанавливающий дисахарид

Дисахариды, в молекулах которых нет полуацетального (гликозидного) гидроксила (сахароза) и которые не могут переходить в открытые карбонильные формы, называются невосстанавливающими (не восстанавливают Cu (OH)₂ и Ag₂O).

Сахароза, в отличие от глюкозы, не является альдегидом. Сахароза, находясь в растворе, не вступает в реакцию «серебряного зеркала» и при нагревании с гидроксидом меди (II) не образует красного оксида меди (I), так как не способна превращаться в открытую форму, содержащую альдегидную группу.

Видеоопыт «Отсутствие восстанавливающей способности сахарозы»

3. Реакция гидролиза

Для дисахаридов характерна реакция гидролиза (в кислой среде или под действием ферментов), в результате которой образуются моносахариды.

Сахароза способна подвергаться гидролизу (при нагревании в присутствии ионов водорода). При этом из одной молекулы сахарозы образуется молекула глюкозы и молекула фруктозы:

Видеоопыт «Кислотный гидролиз сахарозы»

Мальтоза и лактоза при гидролизе расщепляются на составляющие их моносахариды за счёт разрыва связей между ними (гликозидных связей):

Таким образом, реакция гидролиза дисахаридов является обратной процессу их образования из моносахаридов.

В живых организмах гидролиз дисахаридов происходит при участии ферментов.

 

ПОЛУЧЕНИЕ САХАРОЗЫ

Сахарную свеклу или сахарный тростник превращают в тонкую стружку и помещают в диффузоры (огромные котлы), в которых горячая вода вымывает сахарозу (сахар).

 

Вместе с сахарозой в водный раствор переходят и другие компоненты (различные органические кислоты, белки, красящие вещества и др.). чтобы отделить эти продукты от сахарозы, раствор обрабатывают известковым молоком (гидроксидом кальция). В результате этого образуются малорастворимые соли, которые выпадают в осадок. Сахароза образует с гидроксидом кальция растворимый сахарат кальция С₁₂Н₂₂О₁₁·CaO·2Н₂О.

Для разложения сахарата кальция и нейтрализации избытка гидроксида кальция через раствор пропускают оксид углерода ( IV).

Выпавший в осадок карбонат кальция отфильтровывают, а раствор упаривают в вакуумных аппаратах. По мере образования кристалликов сахара отделяют с помощью центрифуги. Оставшийся раствор – меласса – содержит до 50% сахарозы. Его используют для производства лимонной кислоты.

Выделенную сахарозу очищают и обесцвечивают. Для этого ее растворяют в воде и полученный раствор фильтруют через активированный уголь. Затем раствор снова упаривают и кристаллизуют.

ПРИМЕНЕНИЕ САХАРОЗЫ

Сахароза в основном используется как самостоятельный продукт питания (сахар), а также при изготовлении кондитерских изделий, алкогольных напитков, соусов. Ее используют в высоких концентрациях в качестве консерванта. Путем гидролиза из нее получают искусственный мёд.

Сахароза находит применение в химической промышленности. С помощью ферментации из нее получают этанол, бутанол, глицерин, левулиновую и лимонную кислоты, декстран.

В медицине сахарозу используют при изготовлении порошков, микстур, сиропов, в том числе для новорожденных детей (для придания сладкого вкуса или консервации).